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Manipolazione in sicurezza dei campioni di Sars-Cov-2: qual è la giusta cabina di sicurezza microbiologica da utilizzare?

E. Cesana, E. Bruschi, C. Zanini M. Bonifacio (BioAir SpA)

Mentre il mondo affronta la minaccia più grave dei tempi moderni, molti laboratori e ospedali in tutto il mondo sono alla ricerca delle attrezzature di sicurezza necessarie per aumentare la loro capacità di diagnosticare e studiare il nuovo virus Sars-CoV-2. Per quanto riguarda le cabine di sicurezza microbiologica, molti professionisti si chiedono se sia necessario l’uso di cabine di classe III, più costose e difficili da ottenere in breve tempo e grandi quantità, o se le cabine di classe II, più comuni, forniscano la protezione richiesta. L’esperienza di BioAir (produttore di cabine di sicurezza microbiologica), aiuta a fare un po’ di chiarezza. Attraverso la review delle linee guida attuali si dimostrerà che le cabine di sicurezza microbiologica di classe II (EN12469:2000), se utilizzati in un laboratorio adeguatamente attrezzato e secondo le procedure di sicurezza necessarie, con adeguati DPI (Dispositivi di Protezione Individuale), sono la scelta corretta per una manipolazione sicura dei campioni infetti.

Introduzione

In questi giorni, si parla molto di DPI (Dispositivi di Protezione Individuale) come guanti e mascherine facciali, perché estremamente importanti per tutte le persone coinvolte nella cura dei pazienti e per garantire la nostra sicurezza durante l’attuale pandemia di COVID-19.
Tuttavia, esiste un'altra categoria di dispositivi di protezione, i DPC (Dispositivi di Protezione Collettiva), che svolgono un ruolo molto importante, anche se più silenzioso, nella lotta contro Sars-CoV-2 e tutti gli altri patogeni (che ancora causano malattie, sebbene non facciano notizia).
I DPC sono fortemente impiegati in ospedali e laboratori, fornendo un mezzo sicuro a tutti gli operatori sanitari ed i ricercatori per studiare e manipolare agenti patogeni o campioni potenzialmente infetti . I DPC sono impiegati sia in ambienti diagnostici [1-2] sia nella ricerca e sviluppo di nuovi farmaci e terapie [3-4].

Differenze tra cabine di sicurezza microbiologica di classe II e classe III

In Europa tutte le cabine di sicurezza microbiologica devono rispettare i requisiti della normativa comunitaria EN12469:2000 [5]. In questa normativa, una cabina di sicurezza di Classe II è definita come:
"[...] Cabina di sicurezza con apertura frontale attraverso la quale l'operatore può effettuare manipolazioni all'interno dell'area di lavoro e costruita in modo che il lavoratore sia protetto, il rischio di cross-contaminazione tra prodotti basso e la fuoriuscita di contaminazione particolata generata all'interno della cabina è controllata mediante un adeguata filtrazione del flusso d'aria interna e dell'aria di scarico. [...]"[Par 3.5, page 5] (5)

Bioair 1 

Figura 1 - Cabina di sicurezza microbiologica di classe II. Il lavoro avviene attraverso l'apertura anteriore e la barriera aeraulica fornita dall'afflusso d'aria garantisce protezione agli operatori e all'ambiente [6]. (Fonte: Cabina Safemate EVO – BioAir)

Mentre la definizione di Classe III è:
"[...] Cabina di sicurezza in cui l'area di lavoro è totalmente chiusa e l'operatore è separato dal lavoro da una barriera fisica (cioè guanti collegati meccanicamente alla cabina). L'aria in ingresso nella cabina viene continuamente filtrata e l'aria di scarico viene filtrata per evitare il rilascio di microrganismi. [...]" [Par 3.6, pagina 5] [5]

Bioair 2 

Figura 2 - Cabina di sicurezza microbiologica di classe III. I campioni possono essere spostati all'esterno o all'esterno dell'area di lavoro principale tramite il passbox dedicato. La manipolazione del prodotto avviene tramite i guanti installati nella finestra anteriore [6]. Cabina Safe 3 – BioAir]

Ciò significa che, sebbene entrambe le classi condividano lo stesso scopo (fornire protezione agli operatori, all'ambiente e ai prodotti), le cabine di classe III sono progettate con regole di contenimento più restrittive per consentire una manipolazione sicura anche degli agenti patogeni più pericolosi. La tabella 1 riassume le principali differenze tra le due classi di cabine di sicurezza microbiologica.

Funzionalità

Classe II

Classe III

Connessione diretta con
l'ambiente esterno

Sì (apertura anteriore)

No

Accesso all'area di lavoro
per i campioni

Direttamente attraverso l'apertura anteriore

Da un pass-box dedicato
con porte interbloccate

Manipolazione di campioni

Direttamente attraverso l'apertura anteriore

Utilizzando guanti installati
meccanicamente sul vetro anteriore

Barriera principale

Aeraulica (generata dinamicamente
dall'afflusso d’aria)

Fisica (il vetro anteriore è chiuso e sigillato)

Modello di flusso d'aria

Ricircolato al 70%, il 30% espulso e
sostituito dall'afflusso frontale

100% espulso. 100% dell'aria in ingresso
viene filtrata

Filtri sull'aria espulsa

HEPA H14 (tipicamente 1x)

HEPA H14 (tipicamente 2x)

Gestione dell'aria espulsa

Normalmente ricircolata in laboratorio,
opzionalmente canalizzata verso l’esterno

Canalizzata all'esterno con
condotto dedicato

Resistenza alle perturbazioni esterne
dell'aria

Limitata. Le correnti d'aria (finestre, aria
condizionata, passaggio di persone), possono
alterare il flusso di barriera

Sì. L'area di lavoro completamente sigillata evita
qualsiasi interferenza da fonti esterne.

Tabella 1 - Caratteristiche delle cabine di sicurezza microbiologica di classe II e III

Differenze tra agenti patogeni: classificazione del gruppo di rischio

L'OMS fornisce una serie di linee guida per classificare qualsiasi agente patogeno dividendoli in quattro gruppi di rischio (o gruppi di pericolo) [7]. L'effettiva classificazione di un agente patogeno viene quindi lasciata a ogni paese o territorio membro in base alle proprie infrastrutture sanitarie e sociali disponibili. 

Classificazione del gruppo di rischio degli agenti patogeni

Gruppo di rischio 1 (nessuno o basso rischio individuale e comunitario)
Un microrganismo che è improbabile causi malattie umane o animali.

Gruppo di rischio 2 (rischio individuale moderato, basso rischio comunitario)
Un agente patogeno che può causare malattie umane o animali, ma è improbabile sia un grave pericolo per i lavoratori di
laboratorio, 
la comunità, il bestiame o l'ambiente. Le esposizioni di laboratorio possono causare gravi infezioni, ma sono
disponibili misure efficaci 
di trattamento e prevenzione e il rischio di diffusione dell'infezione è limitato.

Gruppo di rischio 3 (alto rischio individuale, basso rischio comunitario)
Un agente patogeno che di solito causa gravi malattie umane o animali, ma di solito non si diffonde da un individuo infetto
ad un altro. 
Sono disponibili misure efficaci di trattamento e prevenzione.

Gruppo di rischio 4 (alto rischio individuale e comunitario)
Un agente patogeno che di solito causa gravi malattie umane o animali e che può essere facilmente trasmesso da un
individuo all'altro, 
direttamente o indirettamente. Di solito non sono disponibili misure efficaci di trattamento e prevenzione.

 Tabella 2 - Linee guida per la classificazione del gruppo di rischio per gli agenti patogeni (7)

Gruppo di rischio e cabine di sicurezza microbiologica: a ciascuno il proprio

Per selezionare l'attrezzatura di protezione adeguata alla manipolazione di un determinato agente patogeno, l'OMS ha pubblicato il "Manuale di biosicurezza di laboratorio" [7], nel quale vengono fornite linee guida molto dettagliate per eseguire una corretta analisi dei rischi e per selezionare di conseguenza le misure di sicurezza pertinenti, dai DPI alle attrezzature di laboratorio, dalla struttura alle procedure operative.
Per quanto riguarda le cabine di sicurezza, la parte più interessante è quanto contenuto nella seguente tabella, da cui si apprende che l'uso di cabine di classe II è indicato per la manipolazione degli agenti patogeni fino al gruppo di rischio 3. 

Gruppo di rischio

Classe di cabine di
sicurezza microbiologica

Gruppo 1-3

Classe I, Classe II, Classe III

Gruppo 4 (laboratorio con cappe
a tenuta stagna )

Classe III

Gruppo 4 (laboratorio con obbligo di indossare
tute pressurizzate a tenuta)

Classe I, II

 Tabella 3 - Guida alla selezione delle MSC basata sulla classificazione del gruppo di rischio dell'agente patogeno. [7]

È tuttavia molto importante notare che la scelta corretta di una cabina di sicurezza non è sufficiente da sola e, in base al gruppo di rischio, devono essere in atto tutti gli altri aspetti della sicurezza (livello di biosicurezza del laboratorio, DPI, procedure operative standard). Deve sempre essere eseguita un'adeguata valutazione dei rischi (Risk Assesment) [8-9] per garantire che tutti i pericoli e i rischi necessari siano stati identificati correttamente e che siano in atto le misure di sicurezza necessarie. Un breve elenco di ciò che deve essere considerato è mostrato nella tabella 4.

Esempio di valutazione dei rischi elenco di argomenti

1. Patogenicità dell'agente e dose infettiva

2. Potenziale risultato dell'esposizione

3. Percorso naturale di infezione

4. Altre vie di infezione, derivanti da manipolazioni di laboratorio (parenterale, aria, ingestione)

5. Stabilità dell'agente nell'ambiente

6. Concentrazione dell'agente e volume di materiale concentrato da manipolare

7. Presenza di un ospite adatto (umano o animale)

8. Informazioni disponibili da studi sugli animali e rapporti di infezioni acquisite in laboratorio o rapporti clinici

9. Attività di laboratorio prevista (sonicazione, aerosolizzazione, centrifugazione, ecc.)

10. Qualsiasi manipolazione genetica dell'organismo che possa estendere la portata ospite dell'agente o alterare
la sensibilità dell'agente a regimi di trattamento noti ed efficaci

11. Disponibilità locale di interventi di profilassi o terapeutici efficaci

Tabella 4 Questo elenco esemplifica gli argomenti che una corretta valutazione dell'elenco deve prendere in considerazione. L'elenco può essere ampliato e implementato in base alle esigenze ed alla situazione contingente [7]

Sars-CoV-2: quali misure adottare?

Con ancora molti aspetti sconosciuti per quanto riguarda l'epidemiologia e la biologia di Sars-CoV-2, le linee guida sono ancora in gran parte un work in progress, continuamente aggiornato per riflettere le nuove conoscenze che vengono generate dai molti laboratori nel mondo che lavorano senza sosta per aiutare l'umanità a combattere questa minaccia.
Tuttavia, ci sono altri coronavirus noti (ad esempio Sars-CoV e Mers-CoV) che condividono somiglianze con Sars-CoV-2, e che hanno permesso all'OMS di fornire linee guida di sicurezza ad-interim [10-11].
Le attuali linee guida (al momento della scrittura del presente articolo) richiedono l'esecuzione di qualsiasi manipolazione di campioni infetti virali non disattivati in una cabina di sicurezza microbiologica. Viene quindi effettuata un'ulteriore distinzione in base alla natura dei processi eseguiti sul campione:

  • Le procedure non propagative, che non richiedono l'amplificazione del carico virale (ad esempio sequenziamento, test con amplificazione degli acidi nucleici), devono essere eseguite in un laboratorio classificato come BSL-2 con le procedure appropriate; [10-11]
  • Le procedure propagative, che richiedono l'amplificazione del carico virale (ad esempio coltura di virus, isolamento o test di neutralizzazione), devono essere eseguite in un laboratorio classificato come BSL-3 con le procedure appropriate [10-11]

Ciò significa che mentre un laboratorio che lavora solo per diagnosticare campioni da pazienti avrà molto probabilmente bisogno solo di una stanza BSL-2, un centro di ricerca che studia il virus per lo sviluppo di un vaccino avrà bisogno di entrambe le stanze BSL-2 e BSL-3 in base al tipo di tecniche che saranno applicate.
Mentre l'OMS non fornisce una classificazione del gruppo di rischio, in quanto è compito di ogni paese membro, le linee guida di manipolazione sono coerenti con un agente patogeno del gruppo di rischio 3. Anche alcuni CCD (Centers for Disease Control) stanno classificando Sars-CoV-2 come virus appartenente al gruppo di rischio 3 [12-14].

Conclusioni

Per riassumere: l'attuale classificazione e le linee guida di Sars-CoV-2, essendo coerenti con un agente patogeno del Gruppo di rischio 3, non impongono l’uso di una cabina di classe III poiché, secondo le attuali linee guida di sicurezza del laboratorio, una cabina di classe II fornisce la sicurezza necessaria per la manipolazione di un agente patogeno RG3, se utilizzato in un laboratorio adeguatamente attrezzato, secondo le necessarie procedure di sicurezza e con adeguati DPI [14].
È inoltre importante assicurarsi che le cabine funzionino correttamente per garantire la sicurezza degli operatori e dell'ambiente. Le linee guida per la corretta manutenzione dell'unità sono fornite da ciascun produttore, e normalmente includono un controllo periodico su flussi d'aria e filtri, la sostituzione del filtro se necessario, la pulizia e la sterilizzazione dell'unità con biocidi (ad esempio vapori di perossido di idrogeno). Poiché la manutenzione corretta della cabina è fondamentale per garantire la sua sicurezza operativa, è estremamente importante assicurarsi che il personale che effettua tale operazione sia stato adeguatamente addestrato e sia qualificato per svolgere il lavoro e, se possibile, sia stato certificato anche da organismi riconosciuti a livello internazionale (ad esempio TUV Nord) [15].
È sempre opportuno ricordare che, per qualsiasi tipo di manipolazione di agenti patogeni, soprattutto se nuovi, deve sempre essere eseguita una corretta valutazione del rischio [7-9]. È inoltre sempre necessario fare riferimento alle autorità ed ai regolamenti locali in quanto potrebbero introdurre ulteriori restrizioni non prese in considerazione in questo documento, soprattutto quando si lavora con rigorosi requisiti di qualità [16-18].

Bibliografia

1. European Parliament, Council of the European Union. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. eur-lex.europa.eu. [Online] 1 11, 2012. [Cited: 3 31, 2020.] https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A31998L0079.

2. THE EUROPEAN PARLIAMENT AND THE COUNCIL OF THE EUROPEAN UNION. Regulation (EU) 2017/746 of the European Parliament and of the Council of 5 April 2017 on in vitro diagnostic medical devices and repealing Directive 98/79/EC and Commission Decision 2010/227/EU (Text with EEA relevance. ). eur-lex.europa.eu. [Online] 4 5, 2017. [Cited: 3 31, 2020.] https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32017R0746.

3. European Commission - Enterprise and Industry Directorate General - Consumer goods - Pharmaceuticals. EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products - revision November 2008. www.gmp-compliance.org. [Online] 11 25, 2008. [Cited: 3 31, 2020.] https://www.gmp-compliance.org/guidelines/gmp-guideline/eu-gmp-annex-1-manufacture-of-sterile-medicinal-products-revision-november-2008.

4. EUROPEAN COMMISSION HEALTH AND CONSUMERS DIRECTORATE-GENERAL. EU GMP Annex 2: Manufacture of Biological Medicinal Products for Human Use. www.gmp-compliance.org. [Online] 6 26, 2018. [Cited: 3 31, 2020.] https://www.gmp-compliance.org/guidelines/gmp-guideline/eu-gmp-annex-2-manufacture-of-biological-medicinal-products-for-human-use.

5. European Committee for Standardization (CEN). EN12469:2000 - Biotechnolgy - Performance criteria for microbiological safety cabinets. s.l. : European Committee for Standardization (CEN), 2000.

6. BioAir SpA. BioAir SpA. bioair.it. [Online] [Cited: 3 30, 2020.] https://www.bioair.it.

7. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual 3rd Edition. WHO. [Online] 2004. https://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf.

8. ISO. IEC 31010:2019 - Risk management — Risk assessment techniques. IEC 31010:2019. 2019.

9. —. ISO 31000:2018 - Risk management — Guidelines. ISO 31000:2018. 2018.

10. World Health Organization. Laboratory biosafety guidance related to the novel coronavirus (2019-nCoV) - Interim guidance. WHO. [Online] 2 12, 2020. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/laboratory-biosafety-novel-coronavirus-version-1-1.pdf?sfvrsn=912a9847_2.

11. —. Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases. WHO.int. [Online] 3 19, 2020. [Cited: 3 27, 2020.] https://www.who.int/publications-detail/laboratory-testing-for-2019-novel-coronavirus-in-suspected-human-cases-20200117.

12. Government of Canada. SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2). Canada.ca. [Online] 2 29, 2020. [Cited: 3 27, 2020.] https://www.canada.ca/en/public-health/services/laboratory-biosafety-biosecurity/biosafety-directives-advisories-notifications/novel-coronavirus-january-27.html.

13. Public Health England. COVID-19: safe handling and processing for samples in laboratories. Gov.uk. [Online] 3 28, 2020. https://www.gov.uk/government/publications/wuhan-novel-coronavirus-guidance-for-clinical-diagnostic-laboratories/wuhan-novel-coronavirus-handling-and-processing-of-laboratory-specimens.

14. US Center for Disease Control. Frequently Asked Questions about Laboratory Biosafety and SARS-CoV-2. CDC.gov. [Online] 3 19, 2020. [Cited: 3 27, 2020.] https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/biosafety-faqs.html.

15. Tuv Nord. List of Certified Technicians. tuev-nord.de. [Online] 2 12, 2020. [Cited: 3 30, 2020.] https://www.tuev-nord.de/fileadmin/Content/TUEV_NORD_DE/pdf/Liste-zert-Servicetechniker.pdf.

16. ICH. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE - PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT Q8(R2). ich.org. [Online] 8 2009. [Cited: 3 30, 2020.] https://database.ich.org/sites/default/files/Q8_R2_Guideline.pdf.

17. —. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE - QUALITY RISK MANAGEMENT Q9. ich.org. [Online] 11 9, 2005. [Cited: 3 30, 2020.] https://database.ich.org/sites/default/files/Q9%20Guideline.pdf.

18. —. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE - PHARMACEUTICAL QUALITY SYSTEM Q10. ich.org. [Online] 6 4, 2008. [Cited: 3 30, 2020.] https://database.ich.org/sites/default/files/Q10_Guideline.pdf.

19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual 4th edition (DRAFT). uab.cat. [Online] [Cited: 3 27, 2020.] https://www.uab.cat/doc/guiaref_ManualBio_4th_WHO.

Gli autori di questo articolo sono attualmente impiegati presso BioAir SpA, una società che produce e vende, tra gli altri prodotti, cabine di sicurezza microbiologica in tutto il mondo. Questo articolo è stato scritto per l'uso del datore di lavoro degli autori per la diffusione nei suoi media, tra cui, ma non solo, sito web, account di social media, newsletter, forma stampata. Le conclusioni e le eventuali dichiarazioni non direttamente provenienti da fonti esterne accreditate devono essere considerate un parere personale degli autori e nessuna responsabilità dove essere implicata nei confronti dell'editore del documento o dei datori di lavoro degli autori. Tutte le informazioni incluse in questo documento sono state controllate con fonti pubbliche e sono corrette al momento della scrittura. Le future revisioni delle linee guida e delle conoscenze sugli argomenti trattati potrebbero rendere questo documento non aggiornato. Si prega di fare sempre riferimento alle autorità locali ed internazionali per qualsiasi aggiornamento sulla sicurezza e la salute.

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